Serangan berterusan penakluk Sepanyol Don Nuño Beltrán de Guzmán ke tanah-tanah barat negara itu, untuk meningkatkan kekuasaan dan kekuasaannya atas wilayah-wilayah tersebut, mengakibatkan terbentuknya sebuah provinsi baru yang disebut Kerajaan New Galicia.
Wilayah ini dihuni oleh berbagai kelompok orang asli, yang terus menerus merosakkan penempatan yang telah didirikan oleh orang Sepanyol di dalamnya. Leftenan Nuño de Guzmán, Kapten Juan B. de Oñate menerima perintah untuk menenangkan provinsi-provinsi tersebut dan menemukan Villa de Guadalajara di tempat yang disebut Nochistlán, suatu kenyataan bahawa dia menyempurnakannya pada 5 Januari 1532. Memandangkan serangan penduduk asli yang sering terjadi di bandar dia terpaksa berpindah setahun kemudian ke Tonalá dan kemudian ke Tlacotlán. Pemindahan ketiga dilakukan untuk menetap kota di Lembah Atemajac, di mana kota ini didirikan secara pasti pada 14 Februari 1542 dengan kehadiran Cristóbal de Oñate sebagai gabenor Nueva Galicia dan Don Antonio de Mendoza, ketika itu, wakil dari Sepanyol Baru, yang melantik Miguel de Ibarra sebagai walikota dan letnan gabenor.
Kota ini berkembang pesat dan mulai bersaing dengan Compostela (hari ini Tepic), yang pada waktu itu merupakan pusat kekuasaan agama dan sipil, sehingga penduduk Guadalajara memberikan tekanan seperti itu kepada pemerintah Audiencia, sehingga raja Felipe II memutuskan untuk mengeluarkan Cédula bertarikh 10 Mei 1560 untuk berpindah dari Compostela ke Guadalajara, Katedral, Mahkamah Diraja dan pegawai Perbendaharaan.
Struktur bandar dirancang sesuai dengan kota-kota kolonial yang lain, jadi susun aturnya dikembangkan dalam bentuk papan catur dari alun-alun San Fernando. Kemudian kawasan kejiranan Mexicaltzingo dan Analco ditubuhkan oleh Fray Antonio de Segovia, dan kawasan kejiranan Mezquitán, salah satu yang tertua. Rumah balai kota juga didirikan, bertentangan dengan kuil San Agustin dan gereja paroki pertama di mana Istana Kehakiman berada.
Hari ini, kota yang megah, produktif dalam bangunan kolonial, mempamerkan sebilangan besar contoh seni bina yang relevan, seperti Katedralnya, sebuah laman web yang mesti dilihat, dibina antara tahun 1561 dan 1618 oleh arkitek Martín Casillas. Gayanya telah digolongkan sebagai baroque yang baru. Strukturnya yang kokoh naik di depan Plaza de Guadalajara hari ini, dengan menara yang ingin tahu bahawa, walaupun mereka bukan dari gaya bangunan yang asal, kini dikenali sebagai simbol ibu kota Guadalajara. Menara primitif hancur pada abad kesembilan belas oleh gempa bumi, sehingga yang sekarang ini ditambahkan. Bahagian dalam kuil ini bergaya separa Gothik, termasuk bilik kebal yang diperbuat daripada renda.
Kawasan keagamaan lain dari abad ke-16 adalah biara San Francisco, yang didirikan pada tahun 1542 berhampiran sungai, di kawasan Analco, dan hampir sama sekali musnah dalam Reformasi. Kuilnya, diubahsuai pada akhir abad ke-17, dengan fasad Baroque dari garis Solomonik sederhana, dipelihara. Biara San Agustin, didirikan pada tahun 1573 oleh Royal Ordinance Felipe II dan pada masa ini memelihara kuilnya dengan fasad garis-garis Herrerian yang teruk dan bahagian dalamnya dengan kubah-kubah bergaris.
Santa María de Gracia, yang lain dari asas konvensional, diduduki oleh biarawati Dominika dari Puebla, yang dibina pada tahun 1590 di hadapan Plaza de San Agustín dan dibayar oleh Hernán Gómez de la Peña. Pembinaannya menempati enam blok, walaupun hari ini hanya kuilnya yang masih ada, dengan fasad neoklasik dari separuh kedua abad ke-18.
